فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

هدف: گیاه عدسک آبی (Lemna minor) به‌دلیل رشد سریع، ساختار ساده و قابلیت کشت آسان، به‌عنوان یک میزبان گیاهی نوظهور برای تولید پروتئین‌های نوترکیب انسانی مورد توجه قرار گرفته است. با این حال، تفاوت‌های موجود در مسیر-N گلیکوزیلاسیون بین گیاهان و انسان، به‌ویژه حضور قندهای گیاهی مانند (1،3)- αفوکوز، محدودیتی اساسی در کاربرد این سیستم برای تولید تجاری پروتئین‌های نوترکیب انسانی در کشاورزی مولکولی ایجاد می‌کند. در این پژوهش، به‌منظور حذف این قند گیاهی، ژن رمز کننده آنزیم (1،3)-α فوکوزیل ترانسفراز (FucT) در گیاه L. minor با استفاده از سامانه ویرایش ژنومی CRISPR/Cas9 هدف قرار گرفت. مواد و روش: به‌منظور ایجاد جهش هدفمند در ژن FucTدر گیاه L. minor ابتدا توالی ژن هدف از پایگاه‌های داده استخراج و با استفاده از PCR و توالی‌یابی، ناحیه مورد نظر در L. minor بومی ایران شناسایی و تأیید شد. سپس sgRNA با کمک ابزارهای بیوانفورماتیکی طراحی و به صورت الیگونوکلئوتیدهای پیشرو و معکوس مکمل سنتز شد. الیگونوکلئوتیدهای پیش ساز پس از واکنش اتصال و تشکیل سختار دو رشته ای در پلاسمید pRGEB32 همسانه‌سازی و سازه نوترکیب ابتدا به باکتری E. Coli و سپس به Agrobacterium tumefaciens منتقل شد. تراریختی گیاه عدسک آبی با استفاده از آگروباکتریوم انجام گرفت. در نهایت، تأیید انتقال سازه و آنالیز جهش‌های ایجاد شده در ناحیه هدف ژن FucT از طریق PCR و تعیین توالی انجام شد.نتایج: فرآیند باززایی لاین‌های احتمالی تراریخت عدسک آبی، ۶ تا ۸ هفته پس از انتقال ژن به‌واسطه‌ی A. tumefaciens با موفقیت انجام شد. تجزیه‌ و تحلیل توالی ناحیه هدف ویرایش در گیاهان دست‌ورزی شده ژنتیکی، با استفاده ازPCR ، توالی‌یابی و انجام آنالیزهای بیوانفورماتیکی، وقوع انواع جهش‌های حذف و درج نوکلئوتیدی (INDELs) را در ژنFucT تأیید کرد. آنالیزهای دقیق کروماتوگرام‌ها نشان داد که سامانه CRISPR/Cas9 موجب القای جهش‌های دوآللی (biallelic) و کایمریک در برخی از گیاهان شده است. نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که سیستم CRISPR/Cas9 توانسته است در محل مورد نظر از ژن FucT گیاه عدسک آبی، جهش‌ ایجاد کند. لاین‌های ویرایش شده فنوتیپ بارزی را از خود نشان ندادند .اگرچه وقوع جهش‌های ژنومی در ناحیه هدف با توالی‌یابی تأیید گردید، اما اثبات قطعی خاموشی کامل ژنFucT و تغییر در الگوی گلیکوزیلاسیون، مستلزم آنالیزهای تکمیلی در سطح پروتئین و گلیکان در مطالعات آینده است.