فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

هدف: با افزایش تقاضای جهانی برای منابع پروتئینی با کیفیت بالا، تولید نوترکیب پروتئین‌های شیر انسانی به‌عنوان گزینه‌ای ایمن، مغذی و پایدار مورد توجه قرار گرفته است. این پژوهش با هدف طراحی و ارزیابی اولیه یک کاست بیانی کلروپلاستی حاوی ژن آلفا-لاکتالبومین انسانی در باکتری Escherichia coli به‌عنوان گام مقدماتی در مسیر تولید گیاهی این پروتئین انجام شد.مواد و روش‌ها: توالی رمزکننده آلفا-لاکتالبومین انسانی با کدون‌های ترجیحی کلروپلاست توتون بهینه‌سازی و در قالب یک کاست بیانی شامل راه‌انداز rrn، ناحیه 5′UTR ژن 10 فاژ 7T و پایان‌دهنده rrnB طراحی گردید. این سازه در ناقل کلروپلاستی pPRV111A همسانه‌سازی شد و با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و برش آنزیمی، صحت ساختاری آن تأیید شد. جهت ارزیابی کارایی ترجمه، پلاسمید نوترکیب به E. coli سویه BL21 (DE3) منتقل و القای بیان با IPTG انجام شد. پروتئین حاصل با روش کروماتوگرافی تمایلی بر پایه رزین نیکل تخلیص و پس از حذف برچسب هیستیدینی با آنزیم TEV، مجموعه HAMLET با اسید اولئیک تولید گردید. فعالیت زیستی این مجموعه با آزمون MTT روی رده سلولی WiDr ارزیابی شد.نتایج: پروتئین آلفا-لاکتالبومین انسانی با وزن تقریبی 16 کیلو دالتون به‌صورت محلول در باکتری بیان شد. خالص‌سازی مؤثر پروتئین از بخش محلول سلولی و حذف موفق برچسب هیستیدینی، منجر به تولید پروتئینی با وزن نهایی حدود 14 کیلو دالتون شد. آزمون‌های تأییدی شامل لکه‌گذاری وسترن و SDS-PAGE بیان موفق و خلوص بالای پروتئین را تأیید کردند. مجموعه HAMLET تهیه‌شده با ترکیب این پروتئین و اسید اولئیک، در آزمون MTT موجب کاهش قابل‌توجه زنده‌مانی رده سلولی WiDr شد. به‌طور خاص، تیمار سلول‌ها با 21 میکرومولار HAMLET باعث کاهش 96 درصدی بقاء سلولی گردید، در حالی‌که تیمارهای جداگانه با آلفا-لاکتالبومین یا اسید اولئیک فاقد اثر معنی‌دار بودند. این نتایج نشان دادند که پروتئین تولیدشده نه‌تنها از نظر ساختاری صحیح است، بلکه ویژگی‌های عملکردی و زیستی مورد انتظار خود را نیز حفظ کرده است.نتیجه‌گیری: کاست بیانی طراحی‌شده دارای کارایی بالا در سیستم باکتریایی بوده و توانسته پروتئینی با فعالیت زیستی مطلوب تولید کند. این مطالعه شواهدی تجربی برای امکان‌سنجی استفاده از این سازه در تراریختی کلروپلاست گیاهان فراهم کرده و گامی مؤثر در مسیر تولید صنعتی آلفا-لاکتالبومین انسانی و ترکیبات زیست‌فعال مشتق از آن مانند HAMLET محسوب می‌شود.