فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

هدف: ویرایش هدفمند ژن‌ها در باکتری‌های پاتوژن مانند Shigella flexneri 2a با استفاده از سیستم پیشرفته CRISPR/Cas9، گام مهمی در توسعه ابزارهای ژنتیکی و استراتژی‌های جدید درمانی است. با این حال، موفقیت این فرآیند به شدت به انتخاب صحیح باکتری‌های ترانسفورم‌شده وابسته است که معمولاً با استفاده از مارکرهای مقاومت آنتی‌بیوتیکی انجام می‌گیرد. در مطالعه حاضر، کارایی مارکرهای آنتی‌بیوتیکی (اسپکتینومایسین و کانامایسین) در وکتورهای پلاسمیدی pTargetF:gRNA-pic و pEcCas در سویه بالینی Shigella flexneri 2a ارزیابی شد.مواد و روش‌ها: ابتدا، ناحیه هدف ژن pic (فاکتور بیماری‌زایی مهم در شیگلا) شناسایی شد. بر اساس این توالی، توالی راهنمای gRNA، پرایمرهای اختصاصی و بازوهای همولوگ (HDR arms) با دقت طراحی شدند. سپس، کلونینگ sgRNA هدفمند به ژن pic در پلاسمید pTargetF انجام شد و صحت ساختار پلاسمید با روش‌های PCR و تعیین توالی تأیید گردید. در مرحله بعد، ورود پلاسمید pEcCas به درون سلول‌های Shigella flexneri 2a با روش شوک حرارتی با موفقیت انجام شد. سپس، پلاسمید pTargetF نوترکیب به همراه بازوهای HDR، با استفاده از روش الکتروپوریشن به باکتری‌های حاوی پلاسمید pEcCas منتقل شدند. انتخاب اولیه کلون‌های ترانسفورم‌شده در مرحله کلونینگ بر روی محیط کشت LB حاوی کانامایسین موفقیت‌آمیز بود. برای بررسی جایگزین‌های احتمالی آنتی‌بیوتیک، سویه وحشی Shigella flexneri 2a نیز بر روی محیط‌های حاوی کلرامفنیکل، آمپی‌سیلین و استرپتومایسین کشت داده شد.نتایج: پس از الکتروپوریشن و کشت سویه‌های نوترکیب و سویه وحشی (کنترل) در محیط حاوی اسپکتینومایسین و کانامایسین، رشد یکنواخت باکتریایی در کل سطح پلیت مشاهده شد، به‌گونه‌ای که امکان تفکیک کلون‌های ترانسفورم وجود نداشت. این عدم توانایی در تفکیک کلون‌های مقاوم، به وضوح نشان‌دهنده مقاومت ذاتی یا گسترده سویه Shigella flexneri 2a به اسپکتینومایسین است. همچنین، در کشت سویه وحشی بر روی محیط‌های حاوی کلرامفنیکل، آمپی‌سیلین و استرپتومایسین نیز رشد بی‌تفاوت و گسترده باکتری مشاهده شد که مؤید مقاومت ذاتی این سویه به چندین آنتی‌بیوتیک رایج است.نتیجه‌گیری: این یافته‌ها تاکید می‌کند که در این سویه خاص، استفاده از اسپکتینومایسین به عنوان مارکر انتخابی نامناسب است. برای ویرایش موفق ژن‌های پاتوژنیک در سویه‌های مقاوم مشابه، پیشنهاد می‌شود از نشانگرهای انتخابی جایگزین که باکتری به آن‌ها حساس است (مانند کانامایسین) یا از سیستم‌های بدون مارکر (markerless) استفاده شود. همچنین، انجام آزمون‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی مقدماتی (حتی به‌صورت ساده‌سازی‌شده) پیش از هر اقدام کلونینگ مولکولی یا ویرایش ژنوم ضروری است.