فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

هدف: اندونوکلئازهای محدودکننده نوع دوم، متداول‌ترین نوع آنزیم‌های محدودکننده هستند که کاربرد وسیعی در مهندسی ژنتیک به‌ویژه همسانه‌سازی ژن‌ها دارند. آنزیم EcoRI از پرمصرف‌ترین آنزیم‌های محدودکننده نوع دو در حوزه مولکولی است. روش مرسوم تولید این آنزیم‌ها استفاده از سویه‌های تغییریافتة باکتری Escherichia coli است که به‌منظور بیش تولید آنزیم EcoRI جهش یافته‌اند. خالص‌سازی آنزیم‌های تولید شده با این روش به ستون‌های متعدد کروماتوگرافی نیاز دارد که هزینه بر و وقت‌گیر است. باتوجه‌به اینکه آنزیم EcoRI دارای ساختاری ساده و بدون پل‌های دی سولفید و به‌صورت مونومر است در این مطالعه تولید آنزیم به روش نوترکیب، روش بهینه خالص‌سازی و بازآرایی این آنزیم مورد بررسی قرار گرفت.مواد و روش:ژن EcoRI از باکتری اشرشیا کولای (E. coli RY13) جداسازی گردید و به‌منظور بیان ژن به‌صورت نوترکیب، در حامل بیانی pET28 همسانه‌سازی و در باکتری E. coli BL21 (DE3) بیان شد. شرایط بهینه بیان پروتئین باتوجه‌به نوع القاگر، غلظت و دما پس از القا مورد بررسی قرار گرفت. بیان پروتئین به‌صورت محلول یا اجسام انکلوزیونی با استفاده از ژل SDS-PAGE بررسی شد. خالص‌سازی و بازآرایی پروتئین نوترکیب با دو روش کروماتوگرافی تمایلی و دیالیز انجام شد. فعالیت آنزیم در مقایسه با آنزیم تجاری EcoRI شرکت ترمو بررسی شد.نتایج: شرایط بهینه بیان EcoRI در غلظت ۸/۰ میلی‌مولار IPTG، دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد تعیین شد. نتایج حاصل از بررسی پروتئین نوترکیب بیان شده روی ژل SDS-PAGE نشان داده است که پروتئین نوترکیب به شکل اجسام انکلوزیونی بیان گردید همچنین حل‌شدن اجسام انکلوزیونی تحت شرایط ملایم واسرشته‌‌سازی اوره ۳ مولار نشان داد که اجسام انکلوزیونی از نوع غیرکلاسیک است. نتایج حاصل از بازآرایی اجسام انکلوزیونی با استفاده از دیالیز و بر روی رزین Ni-NTA مشخص کرد که بازدهی بازآرایی بر روی رزین بیشتر از بازآرایی با استفاده از دیالیز است. واکنش هضم آنزیمی با آنزیم تولیدشده و آنزیم تجاری نشان داد که آنزیم نوترکیب خالص‌شده مشابه آنزیم تجاری قادر به برش DNA پلاسمیدی است. نتیجه‌گیری: بازآرایی اجسام انکلوزیونی بر روی ستون منجر به صرفه‌جویی در وقت و هزینه شده و کارایی بیشتری نسبت به روش دیالیز دارد.