فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

هدف: تولید آنتی‌بادی و کاربرد آن در آزمون‌های متنوع و طراحی بیوسنسورها یکی از راهبردهای مهم در تشخیص ویروس‌های گیاهی است. ویروس ساقه شیاری سیب (Apple stem grooving virus (ASGV)) یکی از ویروس‌های مهم درختان دانه‌دار و سیب ‌می-باشد. هدف از این تحقیق، بیان ژن پروتئین پوششی این ویروس در E. coli و تولید آنتی بادی علیه پروتئین بیان شده و ارزیابی آن در آزمون‌های تشخیصی است.مواد و روش: در واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز، قطعه‌ای به طول 714 جفت باز مربوط به ژن کامل پروتئین پوششی ASGV تکثیر و در پلاسمید pTG19 همسانه‌سازی شد. سپس، قطعه مورد نظر با آنزیم‌های برشی BamHI و EcoRI خارج و در حامل بیانی pET28a(+) همسانه‌سازی شد و سازه مورد نظر به‌منظور بیان ژن هدف، به باکتری E. coli سویه BL21(DE3) منتقل شد. بهینه سازی بیان در غلظت یک میلی مولار IPTG و زمان‌های سه، چهار، شش و 16 ساعت پس از القا صورت گرفت و تایید بیان پس از الکتروفورز عمودی و آزمون وسترن بلات انجام شد. پروتئین بیان شده تخلیص و به‌عنوان آنتی‌ژن به خرگوش تزریق شد. پس از ایمن سازی سرم، ایمنوگلوبولین‌ها از سرم خون تخلیص و بخشی از آنها برای تولید کانجوگیت استفاده شدند. در نهایت، کارایی آنها در آزمون‌های سرولوژیکی ارزیابی شد. یافته‌ها: نتایج تعیین توالی یابی نشان داد قطعات تکثیر یافته در پی‌سی‌آر مربوط به ژن پروتئین پوششی ویروس ساقه شیاری سیب است. نتایج پی‌سی‌آر کلونی و هضم آنزیمی تایید کننده ساخت سازه pET28-ASGV-CP بود. تعیین توالی سازه ساخته شده در دو جهت حاکی از قرار گرفتن ژن پروتئین پوششی در قاب صحیح درون پلاسمید بیان و فقدان جهش نوکلئوتیدی بود. پس از بهینه‌سازی، بیان و استخراج پروتئین پوششی، نوار پروتئینی با اندازه تقریبی 27 کیلودالتون چهار ساعت بعد از القاء در الکتروفورز عمودی و وسترن بلات تایید شد. در الایزی مستقیم، غیر مستقیم و آزمون دیبا، نتایج نشان داد غلظت حدود 1:1000 آنتی‌بادی تخلیص شده در غلظت مناسب آنتی‌ ژن توانایی واکنش مناسب با آنتی‌ژن را دارد. نتیجه گیری: آنتی بادی تولید شده و کانژوگه شده در رقت مناسب در تناسب با غلظت آنتی ژن توانایی اختصاصیت و کارایی لازم برای ردیابی و شناسایی ویروس ساقه شیاری سیب را بخوبی دارد. یکی از کاربردهای این آنتی بادی در طراحی انواع کیت های تشخیصی سرولوژیکی مانند الایزا است.