فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

هدف: اطلاعات کمی در مورد متابولیسم قند و نحوه ادغام آن با سایر مواد، در مقایسه با سایر محصولات فتوسنتزی اولیه (مانند ساکارز و نشاسته) وجود دارد. Mannose-6-phosphate reductase (M6PR) یک آنزیم کلیدی است که در بیوسنتز مانیتول در کرفس نقش دارد. هدف از این پژوهش  همسانه سازی ژن، بررسی بیان ژن و تخلیص آنزیمM6PR  و بررسی عملکرد آن بر روی ژن­های جهش یافته در محیط آزمایشگاهی بوده است. مواد و روش‌ها: ابتدا  استخراج mRNA از گیاه کرفس انجام شدو سپس سنتز cDNA صورت گرفت و محصول به عنوان الگو در تکثیر ژن M6PR  مورد استفاده قرار گرفت..محصول PCR توسط کیت استخراج DNA از روی ژل، تخلیص شد. محصول PCR خالص شده مطابق با دستور العمل T/A Cloning (فرمنتاز) در ناقل pTZ57R همسانه سازی شد. سلول مستعد E.coli سویه Top10 با استفاده از روش بیوشیمیایی کلرید کلسیم تهیه شد و وکتور نوترکیب درون آن ترانسفورم و روی پلیت حاوی آمپی سیلین کشت داده شدند. صحت کلونینگ با استفاده از PCR ژن­M6PR  و هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم های BamHI, SacI (شرکت فرمنتاز) انجام گرفت.  سپسژن M6PR  در پلاسمید بیانی pET32a  همسانه سازی شد و درون باکتری E.coli سویه BL2I انتقال داده شد. پیشبر ژن با IPTG القا شد و با وسترن بلاتینگ مورد بررسی قرار گرفت.  پروتئین تولید شده با ستون کروماتوگرافی تمایلی (His.Tag/S.Tag) تخلیص شد. نتایج: نتایج نشان دادند که آنزیم می­تواند نواحی هترودوبلکس ژن را شناسایی کند.­M6PR  نوترکیب خالص­شده از اشریشیا کلی،دارای فعالیت خاص مولکولی بود. نتایج حاصل از هضم دوگانه پلاسمید با آنزیم­های SacI و BamHI، قطعات 2870 جفت بازی و 186 جفت بازی بود. قطعه حاضر مطابق با نتیجه ازمون بلاست شباهت 100درصدی با ژن M6PR گیاه کرفس داشت. نتایج بررسی رونویسی ژن نوترکیب M6PR نشان داد که میزان رونویسی ژن نوترکیب M6PR در سویه­های تراریخت برابر با 3/2 و در کنترل 32/0 به دست آمد که تفاوت معناداری در سطح P<0.01 را از نظر آماری نشان دادند. پس از القای پیشبر و نمونه برداری در زمان­های مختلف، نمونه­ها روی ژل SDS-PAGE باند پروتئینی در ناحیه 42 کیلو دالتون را نشان داد که نشان دهنده بیان پروتئین به صورت موفقیت آمیز بود. نتیجه‌گیری:  همسانه سازی ژن آنزیمM6PR  بدست آمده از گیاه کرفس و به دنبال آن تولید این آنزیم به صورت نوترکیب در آزمایشگاه می تواند منجر به بیان بالای  آن در سیستم پروکاریوتی  شود به طوریکه آنزیم دارای فعالیت  باشد. همچنین مطالعه حاضر نشان داد که آنزیم­های گیاهی وقتی در باکتری بیان می­شوند، فعال می­باشند و می­توانند به عنوان منبع مناسب برای تسریع فعالیت کاتابولیک استفاده شوند.