فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

مقاله پژوهشیمقدمه: ارزیابی کارآیی برش آنزیم Cas9 در سیستم CRISPR (Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat) و غربال‌گری جهش‌های ایجاد شده، یکی از چالش‌های این سیستم می‌باشد. این مطالعه روشی مبتنی بر استفاده از سیستم پلی‌اکریل‌آمید غیردناتوره، بدون نیاز به تشکیل هترودپلکس با کارآیی بالا را پیشنهاد می‌کند.روش‌ها: در این مطالعه، به منظور بررسی عملکرد سیستم CRISPR-Cas9، ابتدا توالی RNA راهنمای مناسب با توالی هدف، طراحی و سنتز شد. وکتور (PX458) pSpCas9(BB)-2A-GFP با استفاده آنزیم BbsI برش داده و RNA راهنمای در جایگاه برش کلون شد. پلاسمید نوترکیب، استخراج و پس از تأیید صحت کلونینگ با استفاده از تکنیک توالی‌یابی، به رده‌ی سلولی HEK293T ترانسفکت گردید. پس از تأیید انتقال و تعیین درصد ترانسفکت توسط دستگاه فلوسایتومتری، DNA ژنومی سلول‌های حامل وکتور نوترکیب استخراج شد. دو واکنش (Polymerase chain reaction) PCR مختلف در ناحیه‌ی مورد نظر بر روی ژن بتاگلوبین انجام شد و درصد عملکرد آنزیم Cas9 با استفاده از آنزیم اندونوکلئاز T7I (T7EndonucleaseI) و سیستم پلی‌اکریل‌آمید غیردناتوره کننده ارزیابی گردید.یافته‌ها: نتایج هضم آنزیمی T7E1 بر روی ژنوم، نشان‌دهنده‌ی عملکرد 32 درصدی آنزیم Cas9 و نتایج سیستم پلی‌اکریل‌آمید غیردناتوره کننده، نشان‌دهنده‌ی عملکرد 66 درصدی آنزیم بود. به این ترتیب سیستم پلی‌اکریل‌آمید غیردناتوره به طور قابل اعتمادی تغییرات کوچک به اندازه‌ی 5-10 جفت باز (bp) در طول اسید نوکلئیک در محل مورد نظر را نیز تشخیص می‌دهد.نتیجه‌گیری: تکنیک PAGE می‌تواند جایگزین سنجش T7E1 به عنوان یک پروتکل معمول آزمایشگاهی برای ژنوتیپ کردن رده‌های سلولی انسانی تولید شده با سیستم CRISPR/Cas9 شود.