فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

مقدمه: DNA پلیمرازها آنزیم‌هایی هستند که سنتز مولکول DNA را از دئوکسی ریبونوکئوتیدها بر عهده دارند. این آنزیم‌ها ابزارهای ضروری در زیست شناسی مولکولی به حساب می‌آیند. DNA پلیمراز Pfu از یک آرکئوباکتری گرمادوست که در رسوبات دریایی با دمای 100-90 درجه‌ی سلسیوس زندگی می‌کند، جدا گردیده است. این آنزیم، خصوصیت اگزونوکلئازی ۳ به ۵ را دارد که باعث اصلاح خطاهای ناشی از همانندسازی DNA می‌شود.روش‌ها: در این مطالعه، قطعه‌ی کد کننده‌ی ژن DNA پلیمراز Pfu در ناقل بیانی b15-pET کلون گردید. سپس با تغییر شرایط بیان مانند غلظت IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)، زمان و دمای القا، بیان این آنزیم بهینه شد. در نهایت در شرایط بهینه، پروتئین در مقیاس بالا تهیه و به روشی ساده تخلیص گردید. سپس آنزیم تخلیص شده، جهت بررسی فعالیت در واکنش PCR (Polymerase chain reaction) به کارگرفته شد.یافته‌ها: کلونی‌هایی بعد از ترانسفورماسیون پلاسمید نوترکیب ایجاد شد که اکثر آن‌ها حاوی پلاسمید بودند. بیان آنزیم Pfu باندی را در حدود KD ۹۰ در ژل الکتروفورز SDS-PAGE (Sodium do decyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis) نتیجه داد. بیشترین میزان تولید پروتئین با غلظت ۷۵/۰ میلی‌مولار ماده‌ی القا کننده‌ی IPTG، دمای ۳۷ درجه‌ی سلسیوس و ۳ ساعت پس از القا مشاهده شد.نتیجه‌گیری: تخلیص پروتئین با به کارگیری روشی جدید بر مبنای پروتکل Desai منجر به ایجاد محصولی شد که در واکنش PCR فعالیتی مشابه با نمونه‌ی تجاری داشت.