فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

سابقه و هدف: پنیرباد (Withania somnifera) متعلق به خانواده سیب‌زمینی، به صورت یک درختچه کوچک همیشه سبز با ریشه­های غده­ای بزرگ است و در مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری وجود دارد. ترکیبات اصلی پنیرباد، ویتانولیدها هستند که شامل ویتافرینA، ویتانولیدD، ویتانولیدA و ویتانون­ها می‌باشند. ویتافرین A و ویتانون­ها بیشتر در برگ­های پنیرباد وجود دارند، در حالی‌ که ویتانولید  Aعمدتاً در ریشه تولید می­شود. بیوسنتز این متابولیت‌ها به ژن­های فارنسیل پیروفسفات (FPP)، سیکلوآرتنول­سنتاز (CAS)، استرول­متیل ترانسفراز (SMT1) و ‌هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMGR)، مرتبط با مسیرهای متابولیک مربوط بستگی دارد و RNAهای غیرکدکننده مانند miRNA­ها در تنظیم  بیان این ژن­ها و آنزیم­ها نقش دارند. ژن­های miRNA­ها، RNAهای کوچک با طول 18- 24 نوکلئوتید هستند که هیچ پروتئینی کد نمی­کنند و بروز ژن را در گیاهان و حیوانات تنظیم می­کنند. این گروه از RNAهای غیر­رمز کننده نقش مهمی در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی ایفا می­کنند و به‌عنوان تنظیم‌کننده­های منفی بیان ژن در یوکاریوت­ها فعالیت دارند. این تحقیق با هدف شناسایی و بررسی بیان برخی miRNA‌های حفاظت شده دخیل در بیوسنتز ویتانولیدها در گیاه پنیرباد اجرا گردید.مواد و روش‌ها: در این پژوهش، برای انجام آنالیز HPLC از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا متصل به آشکارساز ELSD، مدل C-650 استفاده شد. به منظور شناسایی miRNA های حفاظت شده در گیاه پنیرباد از داده­های  RNA-seqمبتنی بر همولوژی توسط نرم‌افزار C-mii از BLASTn با معیارهای تا چهار عدم تطابق وE- value < 10  استفاده شد. ساختار ثانویه miRNAهای متمایز به وسیله نرم‌افزار Mfold تعیین شد. ژن‌های هدف miRNAهای نامزد با استفاده از psRNATarget بر اساس پارامترهای زیر شامل: E-value < 1.0E-5، تعداد جایگاه­­های مورد هدف برابر2، محدوده نداشتن بازهای مرکزی بین 10-11 نوکلئوتید، بیشترین عدم تشابه برابر 2 و بدون هیچ گونه فاصله انتخاب گردیدند و برای پی بردن به عملکرد ژن­های هدف از ابزارBLASTx  علیه پایگاه داده پروتئینی استفاده شد. در مرحله گلدهی نمونه‌برداری از دو بافت برگ و ریشه سه ژنوتیپ W1 (7629245)،W3  (7629241) و W4 (7629244) با سه تکرار تکنیکی و سه تکرار بیولوژیکی انجام گردید. از Real-time PCR برای ارزیابی بیان miRNA5021 و ژن هدف آن SMT1 و miRNA5140 استفاده شد و تجزیه داده­های حاصل از بیان با استفاده از روش  CTΔΔ -2 انجام شد.  یافته‌ها: با توجه به تجزیه‌های آماری داده­های حاصل از HPLC، بین مقدار ویتافرین­آ در سه ژنوتیپ (W1، W3 و W 4) از لحاظ آماری اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد. در بین بافت­های مورد مطالعه بیشترین میزان مربوط به برگ W3 و کمترین به ریشه W1 اختصاص داده شده است. برای شناسایی miRNAها ساختار دوم توالی­ها با سرور mfold پیش­بینی شد. حداقل انرژی آزاد پیچش (MFE) از 15- تا 4/130- kcal.mol متفاوت بود و میانگین آن 98/42- kcal.mol محاسبه گردید. نتایج حاصل از روش RT-qPCR نشان داد که میزان بیان نسبی miR5021 در ریشه W1، W3 و W4 نسبت به شاهد (بافت برگ W1)، 16/1، 37/1 و 17/1 به ترتیب افزایش بیان و در برگ W3 و W4 به ترتیب 1/3 و 7/3 برابر کاهش بیان مشاهده شد. الگوی بیان برای ژن SMT1 در سه ژنوتیپ W. somnifera برای ریشه W1،  W3و W4 به ترتیب 7/7، 8/2 و 4 برابر کاهش و در برگ W3 و W4 به ترتیب 48/2 و 82/1 برابر افزایش بیان نسبت به  شاهد مشاهده شد. همچنین بیان نسبی miR5140 در برگ W3، 57/1 و برای W4 بدون تغییر و در ریشه,WI  W3 و  W4نسبت به شاهد به ترتیب هفت، نه و سه برابر کاهش بیان دیده شد که طبق انالیزهای آماری برای miRNA5021 و miRNA5140 در بین  سه ژنوتیپ­ برای هر یک از این ژن­ها اختلاف معنی‌داری وجود ندارد.نتیجه­‌گیری: در مجموع با توجه به نقش تنظیمی miRNAهای شناسایی شده در این مطالعه، می­توان از این ژن­ها در شناسایی بهتر و دقیق­تر مسیر بیوسنتز ویتانولیدها استفاده کرد.