فهرست نشریات علمی دسترسی آزاد ایران

مقدمه و هدف: سرخدار (Taxus baccata L.) از درختان سوزنی‌برگ کندرشد و همیشه‌سبز جنگل­های هیرکانی ایران است که به‌دلیل تولید تاکسول، داروی حیاتی ضد سرطان، ارزش دارویی فراوانی دارد. با این حال، غلظت بسیار پایین تاکسول در گونه‌های سرخدار (001/0 تا 02/0 درصد وزن خشک) مانع اصلی بهره‌برداری پایدار است. برای تهیه تنها یک کیلوگرم تاکسول به حدود 10 هزار کیلوگرم پوست یا قطع سه هزار درخت سرخدار نیاز است، درحالی­که درمان یک بیمار سرطانی به سه گرم تاکسول معادل هشت درخت 60 ساله نیاز دارد. این مسئله خطر جدی برای بقای جنگل‌های طبیعی ایجاد می‌کند. از این‌رو، پژوهشگران زیست‌فناوری به‌دنبال روش‌های جایگزین مانند کشت سلول و بافت برای تولید متابولیت‌های ثانویه در مقیاس‌های بزرگ و بدون آسیب به محیط‌زیست هستند. کشت سوسپانسیون سلولی یکی از رویکردهای مؤثر برای تولید متابولیت‌های دارویی در شرایط آزمایشگاهی محسوب می‌شود. استفاده از لاین‌های سلولی پرتوان و گزینش‌شده می‌تواند منجر به افزایش چشمگیر تولید زیست‌توده و تاکسول شود. در این پژوهش، با بهره‌گیری از روش کلونینگ توده‌های سلولی کوچک، لاین‌های سلولی با بازده بالا شناسایی و کشت‌های سوسپانسیون همگن برای تولید کارآمد تاکسول در سرخدار ایجاد شد.مواد و روش‌ها: ریزنمونه‌های ساقه جوان درختچه‌های سرخدار یک ساله در محیط کشت B5 حاوی غلظت‌ها و ترکیبات مختلف اکسین (2,4-D، PIC، NAA) و سیتوکینین (BAP، KIN) برای القای کالوس کشت داده شدند. القای موفقیت‌آمیز کالوس و بهترین ترکیبات فیتوهورمونی توسط عوامل متعددی مانند زمان القای کالوس، مقدار کالزایی و مورفولوژی کالوس (بافت و رنگ) تعیین شد. کالوس‌های مناسب گزینش شدند و برای ایجاد کشت سوسپانسیون سلولی اولیه مورد استفاده قرار گرفتند. پس از ایجاد کشت‌های سوسپانسیون مختلف، لاین‌های سلولی پربازده با استفاده از روش کلونینگ توده‌های سلولی کوچک گزینش شدند. سوسپانسیون‌های سلولی به­دست آمده از لاین‌های برتر گزینش شده از نظر سینتیک رشد، تجمع تاکسول، پایداری رشد و تولید متابولیت مورد آنالیز قرار گرفتند. همه آزمایش‌ها دو بار تکرار شدند و آزمایش‌ها بر پایه طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار تنظیم شدند. آنالیز واریانس داده‌ها و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از نرم­افزار آماری SAS 9.4 انجام شد.یافته‌ها: تأثیر فیتوهورمون‌ها بر روی کالزایی، انواع مورفولوژی کالوس را، بسته به نوع فیتوهورمون و غلظت، نشان داد که ترکیب PIC و KN برای القای کالوس نرم، شکننده و تند‌رشد مؤثرتر بود. چهار کلونی مشتق از تک سلول با ویژگی­های رشدی خوب از کشت‌های مختلف سوسپانسیون سلولی T. baccata با استفاده از روش کلونینگ توده‌های سلولی گزینش و کشت‌های سوسپانسیون سلولی از لاین‌های سلولی گزینش شده ایجاد شدند. پروفیل زمانی رشد سلول‌ها در کشت‌های سوسپانسیون نشان داد که مرحله رشد نمایی تا روز 21 ادامه داشت و به دنبال آن فاز ساکن، که از روزهای 21 تا 28 سیکل رشد ادامه داشت، طی آن رشد سلولی به‌طور محسوسی تغییر نکرد. با توجه به منحنی رشد، بهترین زمان برای تولید تاکسول در فاز نمایی نهایی، یعنی تا روز 21‌ام با بیشینه مقدار رشد سلولی، است. لاین برتر بیشترین مقدار تاکسول (mg/l 07/26) را با تولید قابل توجهی زیست­توده (g DW/l 68/33)  تولید کرد که به­ترتیب تقریباً 15 و 05/2 برابر بیشتر از لاین کم بازده بود. در بررسی دینامیک جمعیت سلولی لاین برتر مشخص شد که اغلب از فراکسیون‌های توده‌های سلولی کروی شکل هستند که توانایی سریع تقسیم و با مقدار زنده‌مانی بالا هستند. آنالیز پایداری لاین‌های گزینش شده نشان داد در بین لاین‌ها از نظر پایداری در تولید زی‌توده و متابولیت در طی ‌واکشت‌های متوالی تفاوت معنی‌دار وجود دارد، که فقط لاین TbCL-J1 از نظر رشد و تجمع زی‌توده و تولید تاکسول پس از پنج نسل واکشت‌، پربازده و پایدار باقی ماند.نتیجه‌گیری: این پژوهش موفق به گزینش یک لاین سلولی پربازده و ایجاد کشت سوسپانسیون سلولی پرتوان برای تولید تاکسول، داروی ارزشمند ضد سرطان شد. میزان تولید تاکسول در لاین منتخب به‌طور چشمگیری (77/0 درصد زی‌توده خشک) بالاتر از مقادیر گزارش‌شده در درختان سرخدار جنگلی (001/0 تا 02/0 درصد) بود. راهبرد انتخاب لاین سلولی علاوه بر افزایش تولید تاکسول، موجب رشد بیشتر زیست‌توده نیز شد. این روش مبتنی بر کلونینگ توده‌های سلولی، قابلیت کاربرد در سایر سیستم‌های کشت گیاهی را دارد. همچنین، کشت همگن حاصل از انتخاب تک‌سلول در سرخدار با سرعتی بیشتر از درختان جنگلی تکثیر می‌شود و برای مقیاس‌پذیری، مهندسی متابولیک و صنعتی‌سازی در بیوراکتور مناسب است، بدون آنکه نیاز به بهره‌برداری مخرب از جنگل‌های بومی ایران باشد.